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# 光甘草定（Glabridin）发酵生产中试项目技术规格书

> 文档类型：工艺技术规格书（Process Technical Specification）
> 项目代号：GGCD-project
> 生产规模：发酵工作体积 1000 L（中试 / Pilot Scale）

| 项目 | 内容 |
| --- | --- |
| 文档编号 | GGCD-SPEC-001 |
| 版本 | V1.0（草案） |
| 密级 | 内部 |
| 编制 |  |
| 审核 |  |
| 批准 |  |
| 生效日期 |  |

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## 修订记录

| 版本 | 日期 | 修订内容 | 修订人 |
| --- | --- | --- | --- |
| V1.0 |  | 初版发布 |  |

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## 目录

1. [总则](#1-总则)
2. [项目概述](#2-项目概述)
3. [产品与质量标准](#3-产品与质量标准)
4. [工艺总流程](#4-工艺总流程)
5. [种子扩培工段](#5-种子扩培工段)
6. [发酵工段](#6-发酵工段)
7. [分离纯化工段](#7-分离纯化工段)
8. [溶剂回收工段](#8-溶剂回收工段)
9. [物料平衡](#9-物料平衡)
10. [主要设备清单](#10-主要设备清单)
11. [公用工程](#11-公用工程)
12. [洁净区与中试车间布局](#12-洁净区与中试车间布局)
13. [自控与仪表](#13-自控与仪表)
14. [质量控制与检测](#14-质量控制与检测)
15. [安全、环保与职业健康](#15-安全环保与职业健康)
16. [验证与确认](#16-验证与确认)
17. [偏差、变更与记录](#17-偏差变更与记录)
18. [技术澄清项](#18-技术澄清项)
19. [附录](#19-附录)

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## 1. 总则

### 1.1 目的

本规格书用于规定以工程化微生物发酵法生产中试规模（1000 L 发酵工作体积）光甘草定（Glabridin）的工艺路线、工段划分、关键工艺参数、设备要求、质量控制及安全环保要求，作为中试装置设计、设备采购、安装调试、工艺验证及试生产的依据。

### 1.2 适用范围

本规格书适用于 GGCD-project 中试车间的以下四个工段：

- **工段一**：种子扩培（Seed Expansion）
- **工段二**：发酵（Fermentation）
- **工段三**：分离纯化（Separation & Purification）
- **工段四**：溶剂回收（Solvent Recovery）

本规格书不适用于后续商业化放大设计，放大设计须另行编制。

### 1.3 编制依据

- 《药品生产质量管理规范》（GMP，2010 年修订）
- 《药品生产质量管理规范附录：原料药》
- GB 50457《医药工业洁净厂房设计标准》
- GB 50160《石油化工企业设计防火标准》
- GB 50016《建筑设计防火规范》
- GBZ 1《工业企业设计卫生标准》
- 《危险化学品安全管理条例》
- ICH Q3C《残留溶剂指导原则》
- ICH Q7《原料药 GMP 指南》
- 企业内部控制标准及同类产品工艺开发报告

### 1.4 术语与缩略语

| 缩略语 | 英文全称 | 中文含义 |
| --- | --- | --- |
| GGCD | Glabridin | 光甘草定 |
| OD600 | Optical Density at 600 nm | 600 nm 吸光度（菌体浓度） |
| DO | Dissolved Oxygen | 溶解氧 |
| DCW | Dry Cell Weight | 细胞干重 |
| YPD | Yeast Extract Peptone Dextrose | 酵母浸出粉胨葡萄糖培养基 |
| CIP | Clean In Place | 在线清洗 |
| SIP | Sterilize In Place | 在线灭菌 |
| PW / WFI | Purified Water / Water for Injection | 纯化水 / 注射用水 |
| DCS | Distributed Control System | 集散控制系统 |
| PLC | Programmable Logic Controller | 可编程逻辑控制器 |
| HPLC | High Performance Liquid Chromatography | 高效液相色谱 |
| VOC | Volatile Organic Compounds | 挥发性有机物 |
| RSD | Relative Standard Deviation | 相对标准偏差 |

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## 2. 项目概述

### 2.1 产品简介

光甘草定（Glabridin）是从甘草中分离得到的异黄烷类黄酮化合物，具有美白、抗炎、抗氧化等生物活性，广泛用于化妆品及功能食品领域。本项目采用合成生物学路线，通过工程化酵母（*Saccharomyces cerevisiae*）发酵法生产，摆脱对甘草植物资源的依赖。

| 项目 | 内容 |
| --- | --- |
| 中文名 | 光甘草定 |
| 英文名 | Glabridin |
| CAS 号 | 59870-68-7 |
| 分子式 | C₂₀H₂₀O₄ |
| 分子量 | 324.37 |
| 外观 | 白色至类白色结晶性粉末 |
| 生产菌种 | 工程化酿酒酵母（基因工程菌，含 GGCD 生物合成途径） |
| 碳源 | 葡萄糖（补料分批） |
| 诱导剂 | 半乳糖（GAL 启动子诱导） |

### 2.2 生产规模

| 参数 | 设计值 | 备注 |
| --- | --- | --- |
| 发酵罐公称容积 | 1500 L |  |
| 发酵工作体积 | 1000 L | 装料系数约 0.67 |
| 设计批次产量（粗品） | ≥ 1.0 kg | 以发酵效价 2.0 g/L 计 |
| 成品纯度 | ≥ 98%（HPLC） |  |
| 设计年运行批次 | 60 批/年 | 双班制，按需调整 |
| 年产能（成品） | 约 60–70 kg/年 | 中试规模 |

### 2.3 工段划分

```
┌──────────┐   ┌──────────┐   ┌──────────────┐   ┌──────────────┐
│ 种子扩培  │──▶│   发酵    │──▶│  分离纯化     │──▶│  溶剂回收     │
│ (工段一)  │   │ (工段二)  │   │  (工段三)     │   │  (工段四)     │
└──────────┘   └──────────┘   └──────────────┘   └──────────────┘
     ▲                                                  │
     └──────────────── 回收溶剂循环利用 ◀───────────────┘
```

---

## 3. 产品与质量标准

### 3.1 成品质量标准（草案）

| 检验项目 | 方法 | 标准 |
| --- | --- | --- |
| 性状 | 目视 | 白色至类白色结晶性粉末 |
| 鉴别 | HPLC 保留时间 / MS | 与对照品一致 |
| 含量（纯度） | HPLC（外标法） | ≥ 98.0% |
| 有关物质 | HPLC | 单一杂质 ≤ 0.5%，总杂 ≤ 2.0% |
| 残留溶剂 | GC（ICH Q3C） | 乙醇 ≤ 5000 ppm，乙酸乙酯 ≤ 5000 ppm |
| 水分 | 卡尔费休法 | ≤ 0.5% |
| 灼烧残渣 | 炽灼法 | ≤ 0.2% |
| 重金属 | 原子吸收 / ICP-MS | ≤ 10 ppm |
| 微生物限度 | 平皿法 | 需氧菌 ≤ 10³ cfu/g，霉菌酵母 ≤ 10² cfu/g |
| 粒度 | 激光粒度仪 | D90 ≤ 50 μm（按客户要求） |

### 3.2 中间体控制指标

| 中间体 | 控制指标 |
| --- | --- |
| 一级种子液 | OD600 ≥ 4.0，无杂菌污染 |
| 二级种子液 | OD600 ≥ 8.0，纯度 ≥ 95%（镜检） |
| 发酵液 | 效价 ≥ 2.0 g/L，残糖 ≤ 5 g/L，OD600 ≥ 60 |
| 提取浓缩液 | 光甘草定含量 ≥ 30%（HPLC 面积归一） |
| 层析洗脱液 | 目标峰纯度 ≥ 85% |
| 结晶粗品 | 纯度 ≥ 95% |

---

## 4. 工艺总流程

### 4.1 工艺流程框图

```mermaid
flowchart TD
    A[工作种子库<br/>甘油管 -80°C] --> B[摇瓶活化<br/>250 mL / 2 L]
    B --> C[一级种子罐<br/>50 L]
    C --> D[二级种子罐<br/>200 L]
    D --> E[发酵罐<br/>1500 L / 1000 L工作体积]
    E -->|补料: 葡萄糖/半乳糖| E
    E --> F[固液分离<br/>离心/膜过滤]
    F --> G[细胞破碎<br/>高压均质]
    G --> H[溶剂提取<br/>乙酸乙酯/乙醇]
    H --> I[减压浓缩]
    I --> J[大孔树脂层析]
    J --> K[硅胶柱层析]
    K --> L[结晶 / 重结晶]
    L --> M[真空干燥]
    M --> N[粉碎 / 包装]
    H -.废溶剂.-> O[溶剂回收工段]
    J -.洗脱溶剂.-> O
    K -.洗脱溶剂.-> O
    O -.回收溶剂回用.-> H
```

### 4.2 流程说明

1. **种子扩培**：工作种子库菌种经摇瓶活化、两级种子罐逐级扩大培养，获得足量、高活力的接种种子液。
2. **发酵**：在 1000 L 发酵罐中进行补料分批培养，控制温度、pH、溶解氧及补料速率，积累光甘草定，发酵结束后放罐。
3. **分离纯化**：发酵液经固液分离收集菌体，破碎后以有机溶剂提取，再经浓缩、树脂层析、硅胶层析、结晶及干燥获得高纯度成品。
4. **溶剂回收**：对提取、层析工序产生的含醇/酯废溶剂进行蒸馏回收，回收溶剂回用于生产，降低单耗与废液排放。

---

## 5. 种子扩培工段

### 5.1 工艺流程

工作种子（甘油管，−80 °C）→ 摇瓶一级活化（250 mL）→ 摇瓶二级扩培（2 L）→ 一级种子罐（50 L）→ 二级种子罐（200 L）→ 移种至发酵罐。

### 5.2 培养基配方

| 培养基 | 组成 | 灭菌条件 |
| --- | --- | --- |
| 摇瓶种子培养基 | YPD：酵母浸粉 10 g/L，蛋白胨 20 g/L，葡萄糖 20 g/L | 121 °C，20 min |
| 一级种子培养基 | YPD + 微量元素 | 121 °C，20 min（糖单独灭菌） |
| 二级种子培养基 | YPD + 微量元素 + 消泡剂 0.1% | 121 °C，20 min（糖单独灭菌） |

### 5.3 关键工艺参数

| 参数 | 一级种子罐 | 二级种子罐 |
| --- | --- | --- |
| 公称容积 | 50 L | 200 L |
| 工作体积 | 30 L | 100 L |
| 接种量 | 摇瓶 2 L（约 6–7%） | 一级种子 30 L（约 30%） |
| 培养温度 | 30 ± 0.5 °C | 30 ± 0.5 °C |
| pH | 5.5 ± 0.2（NH₄OH/H₃PO₄ 控制） | 5.5 ± 0.2 |
| 通气量 | 0.5–1.0 vvm | 0.5–1.0 vvm |
| 搅拌转速 | 150–300 rpm | 120–250 rpm |
| DO | ≥ 20% | ≥ 20% |
| 培养时间 | 12–16 h | 12–16 h |
| 移种标准 | OD600 ≥ 4.0 | OD600 ≥ 8.0 |

### 5.4 过程控制与接受标准

- 每级种子移种前取样镜检，确认无杂菌污染、细胞形态正常。
- 移种采用无菌压缩空气/氮气压送，移种管路 SIP 灭菌。
- 一级/二级种子罐具备温度、pH、DO、消泡在线检测及自动控制。
- 种子液滞留时间不得超过规定上限，否则降级或废弃。

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## 6. 发酵工段

### 6.1 工艺流程

二级种子液按 10%（v/v）接种至 1000 L 发酵工作体积 → 分批培养至葡萄糖耗尽 → 补料分批阶段（葡萄糖限制性流加）→ 诱导阶段（半乳糖诱导）→ 效价达标后放罐。

### 6.2 发酵培养基

| 组分 | 浓度 | 作用 |
| --- | --- | --- |
| 葡萄糖 | 20–40 g/L（初始） | 碳源 |
| 酵母浸粉 | 10 g/L | 氮源/生长因子 |
| 蛋白胨 | 20 g/L | 氮源 |
| (NH₄)₂SO₄ | 5 g/L | 无机氮源 |
| KH₂PO₄ / K₂HPO₄ | 3 / 1 g/L | 缓冲/磷源 |
| MgSO₄·7H₂O | 1 g/L | 镁源 |
| 微量元素（Fe/Zn/Mn/Cu 等） | 适量 | 辅因子 |
| 维生素（生物素、泛酸钙等） | 适量 | 生长因子 |
| 消泡剂 | 0.05–0.1% | 抑泡 |

补料液：葡萄糖 500–600 g/L（含微量元素），诱导期加入半乳糖至终浓度 5–20 g/L。

### 6.3 关键工艺参数

| 参数 | 设计值 | 控制方式 |
| --- | --- | --- |
| 发酵罐公称容积 | 1500 L | — |
| 工作体积 | 1000 L | — |
| 接种量 | 10%（100 L） | 压差移种 |
| 培养温度 | 30 ± 0.5 °C（生长）；诱导期 25 ± 0.5 °C | 夹套循环水温控 |
| pH | 5.5 ± 0.2 | NH₄OH / H₃PO₄ 自动流加 |
| DO | ≥ 20%（不低于 20%） | 通气 + 搅拌级联控制 |
| 通气量 | 0.5–1.0 vvm | 质量流量计控制 |
| 罐压 | 0.02–0.05 MPa | 背压阀 |
| 残糖 | 0–5 g/L（补料期） | 葡萄糖在线分析/流加反馈 |
| 发酵周期 | 144–168 h | — |
| 放罐标准 | 效价 ≥ 2.0 g/L，残糖 ≤ 5 g/L | 取样 HPLC + 生化分析 |

### 6.4 发酵过程控制策略

1. **生长阶段**：温度 30 °C，pH 5.5，DO 联动搅拌与通气维持在 20–40%。
2. **补料阶段**：当初始葡萄糖耗尽（DO 反弹）后启动指数/恒定流加，维持残糖 0–5 g/L，避免 Crabtree 效应产乙醇。
3. **诱导阶段**：OD600 达设定值后加入半乳糖诱导，降温至 25 °C，延长产物积累期。
4. **放罐**：效价连续两次取样达标或达到设定周期后放罐。

### 6.5 染菌防控

- 发酵罐及管路每批 SIP（121 °C，30 min），接种前保压检漏。
- 空气经 0.22 μm 除菌过滤器，蒸汽过滤器定期完整性检测。
- 定期取样涂平板及镜检，发现染菌立即评估并按规定处理。

---

## 7. 分离纯化工段

### 7.1 工艺流程

发酵液 → 固液分离（碟片离心/陶瓷膜）→ 菌体收集 → 高压均质破碎 → 溶剂提取 → 减压浓缩 → 大孔树脂层析 → 硅胶柱层析 → 结晶/重结晶 → 真空干燥 → 粉碎包装。

### 7.2 各单元操作参数

| 单元 | 关键参数 | 控制指标 |
| --- | --- | --- |
| 固液分离 | 碟片离心机 ≥ 8000 rpm 或陶瓷膜 0.2 μm | 菌体回收率 ≥ 96% |
| 细胞破碎 | 高压均质 800–1200 bar，2–3 遍 | 破碎率 ≥ 95% |
| 溶剂提取 | 乙酸乙酯/乙醇，料液比 1:3–1:5，温度 40–50 °C，提取 2–3 次 | 提取率 ≥ 92% |
| 减压浓缩 | 真空度 −0.08～−0.095 MPa，温度 ≤ 50 °C | 浓缩至规定体积 |
| 大孔树脂层析 | D101/AB-8，乙醇梯度洗脱（30%→70%→95%） | 收率 ≥ 88%，纯度 ≥ 70% |
| 硅胶柱层析 | 石油醚/乙酸乙酯梯度洗脱 | 收率 ≥ 82%，纯度 ≥ 90% |
| 结晶 | 乙醇/甲醇体系，降温结晶 | 收率 ≥ 85%，纯度 ≥ 95% |
| 真空干燥 | ≤ 50 °C，真空度 ≤ −0.09 MPa | 水分 ≤ 0.5% |

### 7.3 溶剂与物料

| 溶剂 | 用途 | 安全等级 |
| --- | --- | --- |
| 乙酸乙酯 | 提取 | 甲类易燃（Exd II BT4） |
| 乙醇 | 提取/洗脱/结晶 | 甲类易燃 |
| 石油醚 | 硅胶层析 | 甲类易燃 |
| 甲醇 | 结晶（如适用） | 甲类易燃/有毒 |

### 7.4 纯化过程控制

- 各层析步骤以 TLC/HPLC 跟踪，按纯度切峰收集。
- 洗脱溶剂集中收集送溶剂回收工段。
- 结晶母液回收套用或送回收工段，减少损失。

---

## 8. 溶剂回收工段

### 8.1 工艺流程

含醇/酯废溶剂 → 预处理（过滤/中和）→ 间歇/连续精馏 → 塔顶回收溶剂 → 塔釜残液处理 → 回收溶剂检验合格后回用。

### 8.2 主要回收溶剂及指标

| 溶剂 | 回收方式 | 回收率 | 回收纯度 | 回用要求 |
| --- | --- | --- | --- | --- |
| 乙醇 | 精馏 | ≥ 95% | ≥ 95%（v/v） | 检验合格回用于提取/洗脱 |
| 乙酸乙酯 | 精馏 | ≥ 90% | ≥ 98% | 检验合格回用于提取 |
| 石油醚 | 精馏 | ≥ 90% | ≥ 90% | 回用于层析 |

### 8.3 关键工艺参数

| 参数 | 设计值 |
| --- | --- |
| 精馏塔类型 | 填料塔/板式塔（间歇或连续） |
| 操作方式 | 常压或减压精馏 |
| 塔顶温度 | 按溶剂沸点控制（乙醇 78 °C，乙酸乙酯 77 °C） |
| 回流比 | 1–3（按分离要求调整） |
| 加热方式 | 蒸汽加热（再沸器） |
| 冷凝方式 | 循环冷却水/冷冻水冷凝 |
| 回收溶剂储罐 | 按溶剂种类专罐专用，标识清晰 |

### 8.4 控制与安全

- 精馏系统全程防爆设计，设置温度、压力、液位联锁及超压泄放。
- 回收溶剂按批检验（纯度、水分、不挥发物），合格后方可回用。
- 塔釜残液作为危险废物委外处置，不得直接排放。

---

## 9. 物料平衡

### 9.1 单批物料平衡（设计基准）

以发酵液 1000 L、效价 2.0 g/L（光甘草定总量 2.0 kg）为基准。

| 工序 | 光甘草定输入 (kg) | 收率 | 光甘草定输出 (kg) | 累计收率 |
| --- | --- | --- | --- | --- |
| 发酵液 | — | — | 2.00 | — |
| 固液分离（菌体收集） | 2.00 | 96% | 1.92 | 96.0% |
| 破碎 + 溶剂提取 | 1.92 | 92% | 1.77 | 88.3% |
| 大孔树脂层析 | 1.77 | 88% | 1.55 | 77.7% |
| 硅胶柱层析 | 1.55 | 82% | 1.27 | 63.7% |
| 结晶精制 | 1.27 | 85% | 1.08 | 54.2% |
| 干燥/包装 | 1.08 | 98% | 1.06 | 53.1% |

> 说明：上表为设计目标值，实际收率以中试验证数据为准。综合收率设计目标 ≥ 50%，单批成品（纯度 ≥ 98%）≥ 1.0 kg。

### 9.2 主要原辅料单耗（估算）

| 物料 | 单批用量 | 备注 |
| --- | --- | --- |
| 葡萄糖 | 约 120–180 kg | 含补料 |
| 酵母浸粉/蛋白胨 | 约 30–40 kg |  |
| 半乳糖 | 约 10–20 kg | 诱导剂 |
| 乙酸乙酯 | 约 500–800 L | 部分回收 |
| 乙醇 | 约 800–1200 L | 部分回收 |
| 石油醚 | 约 300–500 L | 部分回收 |
| 纯化水 | 约 3000–5000 L |  |

---

## 10. 主要设备清单

| 序号 | 设备名称 | 规格 | 数量 | 材质 | 备注 |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| 1 | 摇瓶培养箱 | 30–37 °C，±0.5 °C | 1 | — | 种子活化 |
| 2 | 一级种子罐 | 50 L，带温控/pH/DO | 1 | 316L | SIP/CIP |
| 3 | 二级种子罐 | 200 L，带温控/pH/DO | 1 | 316L | SIP/CIP |
| 4 | 发酵罐 | 1500 L，工作 1000 L | 1 | 316L | 补料/SIP/CIP |
| 5 | 补料罐 | 200 L | 2 | 316L | 葡萄糖/诱导剂 |
| 6 | 碟片离心机 | ≥ 8000 rpm | 1 | 316L | 固液分离 |
| 7 | 陶瓷膜过滤系统 | 0.2 μm | 1 | 316L/陶瓷 | 可选 |
| 8 | 高压均质机 | 1000 bar | 1 | 316L | 细胞破碎 |
| 9 | 提取罐 | 1000 L，带搅拌/夹套 | 1 | 316L | 溶剂提取 |
| 10 | 减压浓缩器 | 500 L | 1 | 316L | 浓缩 |
| 11 | 层析柱 | Φ300×1500 mm 等 | 2–4 | 316L/玻璃 | 树脂/硅胶 |
| 12 | 结晶罐 | 300 L，带夹套/搅拌 | 1 | 316L | 结晶 |
| 13 | 真空干燥箱 | ≤ 50 °C | 1 | 316L | 干燥 |
| 14 | 粉碎机/筛分机 | 按粒度要求 | 1 | 316L | 成品 |
| 15 | 精馏塔 | 填料/板式 | 1–2 | 316L | 溶剂回收 |
| 16 | 溶剂储罐 | 500–2000 L | 若干 | 316L | 专罐专用 |
| 17 | 空气压缩机/除菌过滤 | 0.22 μm | 1 | — | 供气 |

> 所有接触物料的设备表面材质应满足 GMP 要求，不锈钢采用 316L，内表面 Ra ≤ 0.6 μm（关键工序）。

---

## 11. 公用工程

| 公用工程 | 参数 | 用途 |
| --- | --- | --- |
| 蒸汽 | 0.3–0.6 MPa（饱和） | 灭菌、加热、精馏 |
| 热水 | 60–90 °C（循环） | 夹套加热、CIP 热水、干燥 |
| 循环冷却水 | 进水 ≤ 32 °C | 冷凝、降温 |
| 冷冻水（冷水） | 7–12 °C | 低温控温、冷凝 |
| 压缩空气 | 0.4–0.7 MPa，无油（工艺气经 0.22 μm 除菌） | 通气、气动 |
| 氮气 | 0.3–0.6 MPa，≥ 99.9% | 压料、惰化、保护 |
| 纯化水（PW） | 符合 ChP | 配液、CIP 清洗 |
| 工艺用水/软化水 | 按工艺要求 | 冷却、清洗 |
| 电 | 380 V/220 V，双回路供电 | 动力、控制系统 |
| 尾气处理 | VOC 处理装置 | 环保 |

> 公用工程接口位置、管径、压力及流量由设计院依据设备负荷表与本章第 12.8 节接口要求确定。

---

## 12. 洁净区与中试车间布局

### 12.1 设计原则

- 中试车间按“人流、物流、气流分开，洁净区与一般区严格分区”的原则进行平面布置。
- 涉及基因工程菌操作的区域满足**生物学隔离**要求，洁净区与一般区、防爆区与非防爆区之间满足**物理隔离**要求。
- 产品直接暴露的工序（结晶、干燥、粉碎、包装）设置于洁净区内，其余密闭/封闭工序设于一般生产区。
- 车间具备 24 小时连续运行能力，空调净化系统、温控系统、监控系统按冗余（N+1）配置。

### 12.2 洁净区划分与洁净等级

| 区域 | 洁净级别 | 相对压差 | 温度/湿度 | 主要工序 |
| --- | --- | --- | --- | --- |
| 菌种保藏/摇瓶区 | D 级背景 + 生物安全柜 | 相对负压 | 20–25 °C / 45–65% | 菌种活化、摇瓶 |
| 种子扩培区 | 一般生产区（封闭系统） | — | 按工艺（30 °C 控温） | 一/二级种子罐 |
| 发酵区 | 一般生产区（封闭系统） | — | 按工艺（30/25 °C 控温） | 发酵、补料 |
| 提取/层析区 | 一般生产区（防爆） | — | 常温，通风 | 提取、浓缩、层析 |
| 精制/结晶区 | D 级 | 相对正压 | 20–25 °C / 45–65% | 结晶、重结晶 |
| 干燥/粉碎/包装区 | D 级 | 相对正压 | 20–25 °C / 45–65% | 干燥、粉碎、内包 |
| 溶剂回收区 | 一般生产区（防爆） | — | 常温，防爆通风 | 精馏、储罐 |
| 微生物/中控实验室 | BSL-2 相应区域 | 相对负压 | 20–25 °C | 检验、监测 |

> 洁净级别最终按产品用途（化妆品/药用原料）及法规要求确定；非无菌原料药暴露工序一般不低于 D 级。

### 12.3 中试车间功能分区与布局

```
┌──────────────────────────────────────────────────────────────┐
│                        中试车间（示意）                        │
│  ┌────────────┐   ┌────────────┐   ┌──────────────────────┐  │
│  │ 菌种/摇瓶   │   │ 种子扩培   │   │       发酵区          │  │
│  │ (D+生物柜) │──▶│ 50L/200L   │──▶│      1500L 发酵罐     │  │
│  └────────────┘   └────────────┘   └──────────┬───────────┘  │
│                                               │              │
│  ┌────────────┐   ┌────────────┐   ┌──────────▼───────────┐  │
│  │ 精制/结晶   │◀──│ 提取/层析   │◀──│      固液分离/破碎     │  │
│  │   (D级)    │   │  (防爆)     │   │                      │  │
│  └─────┬──────┘   └─────┬──────┘   └──────────────────────┘  │
│        │                │                                    │
│  ┌─────▼──────┐   ┌─────▼──────┐   ┌──────────────────────┐  │
│  │ 干燥/包装   │   │  溶剂回收   │   │ 公用工程间（水电气/冷热）│  │
│  │   (D级)    │   │  (防爆)     │   │                      │  │
│  └────────────┘   └────────────┘   └──────────────────────┘  │
└──────────────────────────────────────────────────────────────┘
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- 功能分区：菌种区、发酵区、纯化区、精制包装区、溶剂回收区、公用工程区、仓储区、质检区。
- 洁净区设置人员更衣缓冲（一更/二更/风淋）与物料气闸/传递窗。
- 防爆区集中布置，设置泄爆面、防爆墙及独立通风系统。

### 12.4 生物学隔离与物理隔离要求

**生物学隔离（针对基因工程菌）**

- 生产菌为基因工程酿酒酵母，按相应生物安全等级管理，操作区域保持相对负压或密闭。
- 发酵尾气经 **0.22 μm 疏水除菌过滤器**过滤后排放，防止重组微生物气溶胶逸散。
- 发酵废液、废菌体、废渣经**灭活处理**（121 °C、30 min 湿热灭活或等效化学消毒）后方可进入后续处理。
- 菌种操作、取样、接种在生物安全柜或超净工作台内进行，废弃物分类收集并高压灭菌。
- 车间排水设独立收集与消毒单元，防止重组菌随污水外排。

**物理隔离**

- 洁净区与一般生产区之间设实体隔断，通过气闸/缓冲间连接，压差梯度明确（洁净区相对正压，产尘/生物操作区相对负压）。
- 防爆区与非防爆区之间设防火墙分隔，防火分区面积满足 GB 50016。
- 洁净区墙面、地面、吊顶采用不产尘、易清洁、耐腐蚀材料（彩钢板、环氧自流平、圆弧角处理）。
- 公用工程管线、排水地漏设置防倒灌与空气阻断，防止交叉污染。

### 12.5 人流、物流与气流组织

| 流线 | 组织方式 |
| --- | --- |
| 人流 | 更衣（一更/二更）→ 风淋 → 洁净区；退出设缓冲，单向流 |
| 物流 | 物料经外清/传递窗/气闸进入；成品经专用通道出，避免交叉 |
| 气流 | 洁净区采用初效+中效+高效（HEPA）三级过滤，非单向流/局部单向流 |
| 压差 | 洁净区 > 缓冲 > 一般区；生物操作区/产尘区保持相对负压 |
| 废弃物 | 专用密闭容器、专用通道，先灭活后外运 |

### 12.6 暖通空调与 24 小时恒温控制

- 空调净化系统（HVAC）24 小时连续运行，关键机组按 N+1 冗余配置，配备备用电源/发电机。
- 洁净区温度控制 20–25 °C、相对湿度 45–65%，换气次数按洁净级别确定。
- 发酵工段由**独立温控循环水系统**（热水/冷冻水夹套循环）实现 30 °C / 25 °C 恒温，控制精度 ± 0.5 °C，24 小时不间断。
- 设置在线温湿度监测与超限报警，空调系统故障自动切换备用机组。
- 排风系统对防爆区、生物操作区、产尘区独立设置，经处理后排放。

### 12.7 远程监控系统

- 采用 **PLC/DCS + SCADA** 架构，集成发酵、纯化、溶剂回收及公用工程数据。
- 支持**远程监控**：通过专线/VPN 加密访问，可在办公室、手机 APP 或 Web 端实时查看工艺参数、设备状态与报警。
- 关键参数（温度、pH、DO、压力、液位、电导率等）实时采集，超限自动声光报警并推送短信/APP 通知。
- 配置视频监控（CCTV），覆盖发酵区、纯化区、溶剂回收区及主要出入口。
- 数据本地服务器 + 异地备份双存储，满足 GMP 数据完整性与审计追踪要求。
- 网络安全满足等级保护要求，远程访问具备身份认证、权限分级与操作日志。

### 12.8 CIP / SIP 系统

**CIP（在线清洗）**

| 步骤 | 清洗介质 | 条件 |
| --- | --- | --- |
| 预冲洗 | 回收水/纯化水 | 常温 |
| 碱洗 | 1–2% NaOH | 80 ± 5 °C，循环 20–30 min |
| 中间冲洗 | 纯化水 | 至中性 |
| 酸洗 | 0.5–1% 硝酸/磷酸 | 60–80 °C，循环 15–20 min |
| 终冲洗 | 纯化水（PW） | 在线电导率/pH 合格 |
| 吹干 | 洁净压缩空气 | — |

- CIP 系统覆盖种子罐、发酵罐、补料罐、提取罐、层析柱、管路及储罐。
- 在线监测电导率、pH、温度、流量，清洗记录可追溯；按清洁验证确定残留限度。

**SIP（在线灭菌）**

- 种子罐、发酵罐、补料系统及移种管路采用**纯蒸汽 SIP**，121 °C、30 min（或 F₀ ≥ 15）。
- 罐体及管路设多点温度探头，验证冷点温度；SIP 后保压检漏。
- 空气过滤器、取样阀、补料口等设独立灭菌接口，保证无菌边界完整。

### 12.9 公用工程接口要求

| 接口 | 参数 | 接口位置/备注 |
| --- | --- | --- |
| 供水（纯化水） | 符合 ChP，≥ 0.2 MPa | 配液、CIP 终冲洗 |
| 供水（工艺/软化水） | 常温，按需 | 冷却、预冲洗 |
| 热水 | 60–90 °C，循环 | 夹套加热、CIP 热水 |
| 冷水（冷冻水） | 7–12 °C，循环 | 发酵降温、冷凝、结晶 |
| 循环冷却水 | ≤ 32 °C | 冷凝器、公用换热 |
| 蒸汽 | 0.3–0.6 MPa 饱和 | SIP、加热、精馏 |
| 压缩空气 | 0.4–0.7 MPa 无油，工艺气除菌 | 通气、气动、吹干 |
| 氮气 | 0.3–0.6 MPa，≥ 99.9% | 压料、惰化、保护 |
| 电 | 380 V/220 V，双回路 | 动力、控制、UPS |
| 排水 | 清污分流，生物废水先灭活 | 环保处理 |

---

## 13. 自控与仪表

### 13.1 控制系统

- 发酵工段采用 PLC + 上位机 SCADA 或 DCS，实现温度、pH、DO、补料、消泡的自动控制与数据记录。
- 关键参数具备超限报警、联锁与数据追溯（审计追踪）。
- 分离纯化及溶剂回收工段采用 PLC 控制，精馏系统具备安全联锁。

### 13.2 在线检测仪表

| 仪表 | 测点 | 精度要求 |
| --- | --- | --- |
| 温度传感器（Pt100） | 各罐/塔 | ± 0.5 °C |
| pH 电极 | 种子罐/发酵罐 | ± 0.05 |
| DO 电极 | 发酵罐 | ± 2% |
| 质量流量计 | 通气/补料 | ± 1% |
| 压力变送器 | 各罐/塔 | ± 1% |
| 液位计 | 储罐/塔釜 | ± 2% |
| 在线葡萄糖分析仪 | 发酵罐 | — |
| 尾气 O₂/CO₂ 分析仪 | 发酵尾气 | — |

### 13.3 数据与追溯

- 所有批次数据自动采集并存档，满足 GMP 数据完整性（ALCOA+）要求。
- 电子记录具备权限管理与审计追踪。

---

## 14. 质量控制与检测

### 14.1 检测能力配置

| 仪器/方法 | 用途 |
| --- | --- |
| HPLC（C18 柱，UV 检测） | 效价、纯度、有关物质 |
| GC（顶空） | 残留溶剂 |
| 卡尔费休水分仪 | 水分 |
| 原子吸收 / ICP-MS | 重金属 |
| 微生物限度检查 | 微生物 |
| 镜检/平板 | 染菌监测 |
| 激光粒度仪 | 粒度 |

### 14.2 取样点与频次

| 工序 | 取样点 | 频次 |
| --- | --- | --- |
| 种子扩培 | 各级种子液 | 移种前 |
| 发酵 | 发酵液 | 每 12 h 及放罐 |
| 提取 | 提取液/浓缩液 | 每批 |
| 层析 | 洗脱液 | 分段 |
| 结晶 | 结晶粗品 | 每批 |
| 成品 | 成品 | 每批全检 |

### 14.3 质量标准

按第 3 章执行；中控指标按第 3.2 节执行。

---

## 15. 安全、环保与职业健康

### 15.1 安全

- 乙醇、乙酸乙酯、石油醚、甲醇等为甲类易燃/有毒溶剂，相关区域按防爆区设计（Exd II BT4 及以上）。
- 溶剂储罐区、精馏区设置可燃气体报警、静电接地、氮封及消防设施。
- 发酵罐带压操作，设置安全阀/爆破片及压力联锁。
- 高压均质、离心等转动设备设置防护罩与急停。

### 15.2 环保

- 废溶剂优先回收回用；不可回收残液作为危险废物委外处置。
- 发酵废液经灭活后进入污水处理系统，达标排放。
- 有机废气经冷凝/吸附/焚烧（VOC 处理）后达标排放。
- 菌体废渣按生物废弃物规定灭活处理。

### 15.3 职业健康

- 溶剂作业岗位配备防毒面具、防护手套、护目镜及局部排风。
- 定期进行职业危害因素检测与员工健康监护。
- 现场设置洗眼器、应急喷淋及急救设施。

---

## 16. 验证与确认

| 验证类别 | 内容 |
| --- | --- |
| 设计确认（DQ） | 设备/系统设计符合本规格书要求 |
| 安装确认（IQ） | 设备安装、材质、仪表校准、文件 |
| 运行确认（OQ） | 空载/水试运行，控制功能、报警、联锁 |
| 性能确认（PQ） | 带料运行，工艺参数与产品质量 |
| 工艺验证（PV） | 连续 3 批合格批次验证工艺稳定性 |
| 清洁验证 | CIP 效果、残留限度、交叉污染控制 |
| 分析方法验证 | HPLC/GC 等方法学验证 |

工艺验证批次须满足：效价 ≥ 2.0 g/L、综合收率 ≥ 50%、成品纯度 ≥ 98%、质量稳定、无重大偏差。

---

## 17. 偏差、变更与记录

- 生产过程中出现偏差须及时记录、评估、调查并采取纠正预防措施（CAPA）。
- 工艺参数、设备、物料、供应商等变更须经变更控制程序审批。
- 所有批记录、检验记录、设备记录按 GMP 要求保存，保存期限不少于产品有效期后一年。

---

## 18. 技术澄清项

### 18.1 说明

本章汇总项目在设计、采购、施工及验证前需与相关方（业主 / 设计院 / 设备供应商 / 工艺方）澄清的技术事项，作为技术交底、接口确认与商务谈判的依据。澄清结论须书面确认，涉及规格变更时按第 17 章变更控制程序更新本规格书并升版。

### 18.2 技术澄清项清单

| 编号 | 类别 | 澄清事项 | 涉及章节/工段 | 需澄清内容 | 责任方 | 期望节点 | 状态 |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| CL-01 | 工艺 | 工程菌株效价与发酵周期 | 6 发酵 | 摇瓶/小试实测效价、补料策略、诱导条件 | 工艺方 | 设计前 | 待澄清 |
| CL-02 | 工艺 | 分离纯化各步收率与纯度 | 7 分离纯化 | 各单元实测收率、层析介质选型 | 工艺方 | 设计前 | 待澄清 |
| CL-03 | 工艺 | 溶剂回收方式 | 8 溶剂回收 | 间歇/连续精馏、回收率与纯度指标 | 工艺方/设计院 | 设计前 | 待澄清 |
| CL-04 | 厂房 | 洁净区等级 | 12 洁净区 | D 级/C 级及产品用途（化妆品/药用） | 业主/法规 | 设计前 | 待澄清 |
| CL-05 | 生物安全 | 生物安全等级与隔离措施 | 12.4 | 菌株生物安全等级、尾气/废水灭活要求 | 业主/安评 | 设计前 | 待澄清 |
| CL-06 | 设备 | 设备材质与表面粗糙度 | 10 设备 | 316L、Ra 要求、关键工序界定 | 业主/供应商 | 采购前 | 待澄清 |
| CL-07 | 设备 | 高压均质/离心参数 | 7.2 | 破碎压力、遍数、处理能力 | 工艺方/供应商 | 采购前 | 待澄清 |
| CL-08 | 公用工程 | 24 h 恒温控制精度与冗余 | 12.6 | 温控精度、N+1 方案、备用电源 | 设计院 | 设计前 | 待澄清 |
| CL-09 | 公用工程 | 冷/热水与压缩空气负荷 | 11、12.9 | 冷量、热量、气量及接口参数 | 设计院 | 设计前 | 待澄清 |
| CL-10 | 公用工程 | 纯蒸汽与 CIP 能力 | 12.8 | 纯蒸汽产量、CIP 覆盖范围 | 设计院/供应商 | 设计前 | 待澄清 |
| CL-11 | 自控 | 远程监控接入方式 | 12.7、13 | VPN/专线/云、网络安全等级 | 业主/IT | 设计前 | 待澄清 |
| CL-12 | 自控 | 数据完整性与审计追踪 | 13.3 | 电子记录、权限、备份策略 | 业主/QA | 设计前 | 待澄清 |
| CL-13 | 质量 | 成品质量标准与残留溶剂限度 | 3、14 | 纯度、残留溶剂、微生物限度 | 业主/QA | 验证前 | 待澄清 |
| CL-14 | EHS | 废水/废气排放标准与灭活方式 | 15 | 排放限值、危废处置 | 业主/EHS | 设计前 | 待澄清 |
| CL-15 | EHS | 防爆分区范围 | 15.1 | 甲类溶剂防爆区划分 | 设计院 | 设计前 | 待澄清 |
| CL-16 | 法规 | 注册与合规路径 | 1.3 | 化妆品/药用原料注册要求 | 业主/法规 | 立项阶段 | 待澄清 |

### 18.3 待确认事项（TBD）

1. 工程菌株具体效价水平及发酵周期以摇瓶/小试数据为准（CL-01）。
2. 分离纯化各步骤收率需中试验证（CL-02）。
3. 溶剂回收精馏塔配置（间歇/连续）需结合溶剂种类与用量确定（CL-03）。
4. 洁净区划分及 GMP 等级需结合产品最终用途（化妆品/药用）确定（CL-04）。

### 18.4 澄清流程

1. 各方对清单逐项核对，填写澄清意见并注明依据。
2. 澄清会议形成会议纪要，明确结论、责任人与完成时间。
3. 未闭环项纳入项目风险清单跟踪；涉及规格变更的按变更程序执行。
4. 全部澄清项闭环后，本规格书升版为正式版（V2.0）。

---

## 19. 附录

### 附录 A：工艺控制点汇总（CPP / CQA）

| 类型 | 项目 | 控制范围 |
| --- | --- | --- |
| CPP | 发酵温度 | 30 ± 0.5 °C（诱导期 25 ± 0.5 °C） |
| CPP | 发酵 pH | 5.5 ± 0.2 |
| CPP | DO | ≥ 20% |
| CPP | 补料残糖 | 0–5 g/L |
| CPP | 提取温度 | 40–50 °C |
| CPP | 精馏塔顶温度 | 按溶剂设定 |
| CQA | 成品纯度 | ≥ 98% |
| CQA | 残留溶剂 | 符合 ICH Q3C |
| CQA | 水分 | ≤ 0.5% |

### 附录 B：参考文件

- 工程菌株构建及发酵工艺开发报告
- 分离纯化工艺开发报告
- 溶剂回收工艺开发报告
- 设备供应商技术资料
- 相关法规与标准清单

### 附录 C：技术澄清项

技术澄清项详见第 18 章。

---

*本规格书为草案，所有工艺参数与指标须经中试验证后最终确认。*